VHH纳米抗体天然文库筛选_GFP Beads

产品简介

Ni-IDA Agarose 6FF 是利用Ni²⁺与蛋白质侧链上的某些氨基酸(主要为组氨酸、半胱氨酸、色氨酸)相互作用而进行分离纯化，适用于6 x His / 10 x His 标签蛋白及与Ni²⁺具有相互作用的生物分子的分离纯化。

特点：

1. 快速、成本低。

2. 使用范围广、操作简单，适合重力柱和预装柱（蠕动泵或者层析系统）。

3. 多重选择，当Ni²⁺不能获得较好的应用时，可以螯合其它的金属离子进行使用（例如Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Ca²⁺等）。

备注：当螯合Ca²⁺时，避免使用磷酸盐缓冲液（会形成沉淀）。

产品属性

项目	参数
基质	6%高度交联的琼脂糖
粒径范围	45-165µm
结合载量	>30mg (his标签蛋白)/ml(介质)
pH稳定性	3-12(长期) 2-14(短期)
化学稳定性	避免使用螯合剂（例如EDTA、EGTA）和还原剂（例如DTT和DTE）
流速	≧300cm/h
操作压力	≤0.3 MPa
贮存溶液	含20%乙醇的PBS
贮存温度	2-8℃

常见问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
纯化时目的蛋白不与介质结合或结合量较低	上样量过载，上样流速过快	降低上样量，降低上样流速
	蛋白或脂类在介质中聚集影响结合	及时有效地清洗介质或更换新的介质
	表达条件过于剧烈,His标签被包裹，不能与介质结合	建议做一个空载体作为表达和纯化的对照，确定表达条件是否合适
	初始样品中没有组氨酸标签蛋白	通过基因序列或His标签抗体核实
	目的蛋白出现在流穿中	目标蛋白没有成功表达或样品与平衡液中pH及组分不正确
洗脱组分别没有收集到目的蛋白或只收集到少目的蛋白	目的蛋白没有与介质结合或结合量较少	先确认目标物是否与介质结合
	蛋白折叠导致标签不能暴露	尝试使用变性条件
	洗脱时间不够	降低流速，延长洗脱液的保留时间
	洗脱体积过小	加大洗脱体积
	洗杂时，目的蛋白被洗下来	降低洗杂液中的咪唑浓度或者提高wash Buffer的pH
	目标物在洗脱液条件下出现聚集沉淀	检测目标物在洗脱液条件（pH和盐浓度）下的溶解度和稳定性。可以尝试在洗脱液中加入一些添加剂：如0.2% Triton X-100或0.5% Tween-20
	目的蛋白可能是包涵体，没有在上清中	可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式
	重组蛋白表达量太低	优化表达条件
	重组蛋白和纯化介质之间的亲和力过高	降低Elution Buffer的pH值，或增加Elution Buffer中咪唑浓度；使用10~100 mM EDTA 溶液剥离镍离子，同时得到目的蛋白
	蛋白降解	在4℃下进行纯化操作，菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂
目的蛋白纯度较低	样品没有经过前处理	样品上柱前必须要经过离心或过滤
	样品粘度过高	样品中含有高浓度核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I(终浓度5ug /ml),Mg2+(终浓度1mM),冰上孵育10~15min
	洗杂不彻底	加大洗杂体积直至基线平稳并与平衡液一致
	杂质蛋白或脂类在介质中聚集沉淀	及时有效地清洗介质
	杂质与Ni2+具有较高的亲和力。	用其它类型介质进行纯化（如离子或分子筛）
	柱料装填效果不佳	重新装填或购买
	杂质与介质出现非特异性吸附	适当选择添加剂降低非特异性吸附,可以尝试在样品中加入一些添加剂：如0.5%Triton X-100、1.0% Tween 20或50%甘油
	分离柱顶部有较大储样体积	重新装柱或降低储样体积
	介质中有微生物生长	介质使用完后，请及时正确保存介质
	样品中含有其他的组氨酸标签蛋白	通过调节PH值，或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段（如离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分
填料颜色变浅或者变成白色	镍离子脱落或被剥离	填料重新挂镍离子
填料呈现褐色	缓冲液中有DTT	对Ni IDA Beads，不能耐受DTT,建议使用Ni NTA Beads。使用时建议降低DTT的浓度至2 mM以下，或者改用巯基乙醇
上样过程中蛋白发生沉淀	操作温度过高	4℃下进行上样，在样品核所有缓冲液中添加稳定剂
上样过程中蛋白发生沉淀	蛋白沉降	改变缓冲液，ph与等电点相差至少一个单位
介质载量下降	上样流速过快	降低上样流速
	蛋白或脂类在介质中聚集，导致载量下降	及时清洗介质
	使用次数过多	更换新介质
	表达条件过于剧烈,His标签被包裹，不能较好与介质结合	建议做一个空载体作为表达和纯化的对照，确定表达条件是否合适
色谱峰上升过陡	介质装填过紧	重新装柱
色谱峰上升过缓或拖尾	介质装填太松	重新装柱
柱床有裂缝或干涸	出现泄露或大体积气泡引入	检查管路是否有泄露或气泡，重新装柱
液流较慢	蛋白或脂类聚集	及时清洗介质或滤膜
	蛋白沉淀在介质中	调整平衡液和洗脱液组分，以维持目标物的稳定性和介质的结合效率
	分离柱中微生物生长	所用试剂必须经过过滤和脱气；样品上柱前必须离心或过滤

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