羊驼单域抗体和纳米抗体


羊驼重链抗体(HcAb)为天然存在的仅由两条重链组成的特殊抗体,只包含一个重链可变区(VHH, Variable Domain of Heavy Chain Antibody)和两个常规的CH2CH3区。羊驼重链抗体通过重链上的一个可变区(VHH)结合抗原,该可变区可以单独稳定地在体外存在,被称为纳米抗体(Nanobody)。纳米抗体晶体宽为2.5nm,长4nm,分子量仅为传统完整抗体的1/10(约15KD)但依然具有完整的抗原识别能力,一般通过噬菌体筛选得到完整抗体序列。得益于纳米抗体微小的结构、完整的抗原识别能力以及噬菌体筛选技术,纳米抗体表现出高亲合力、高特异性、强穿透性和易于改造和表达等特点,并且由于可以获得抗体完整序列,纳米抗体可以通过体外重组表达高质量稳定生产,有效避免传统抗体的批次间差异问题。

纳米抗体的优点

和传统抗体相比,VHH分子量小,结构简单。而得益于分子量小的优势,VHH更进一步具有以下特征:

1)和靶点结合特异性更强;

2)更高的组织穿透力;

3)更高的稳定性;

4)适合工业化大规模生产;

5)更容易体外改造和优化;

6)更容易人源化



纳米抗体的筛选制备

纳米抗体一般通过免疫羊驼然后构建噬菌体文库,并使用噬菌体筛选技术筛选制备。



噬菌体展示技术是一种由Simth1985年建立的用于识别蛋白质和它相互作用蛋白的体外筛选技术。噬菌体展示的具体原理是将外源蛋白质的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个基因上,使外源基因随着外壳蛋白的表达而表达,最终蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。被展示的蛋白或者多肽可以保持相对的空间结构和生物活性,因而可以利用靶蛋白对其进行筛选。

 

构建抗体文库是利用噬菌体展示技术进行高亲和力抗体筛选的第一步。通过将抗体基因克隆到相应噬菌体载体上可以将外源基因插入噬菌体基因适当位置并随着随着噬菌体传代,最终使外源蛋白展现在子代噬菌体的表面。

 

筛选的方法主要分为固相筛选和液相筛选两种。通过生物淘洗法、竞争法、消减法、选择性感染筛选、延迟性感染筛选等方法可以对和靶蛋白强力结合的基因片段筛选出来。具体地,筛选过程以靶蛋白为固定相,以噬菌体展示文库为流动相,经过一段时间的共同孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,即可得到与靶蛋白具有高亲和性的抗体。

 

经过筛选后,对筛选得到的蛋白进一步用酶联免疫吸附测定或免疫印迹法对其进行特异性筛选,获取目的克隆或铺盘进行单克隆分离继而进行大规模生产。



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